Science | 邵峰：GSDMB被颗粒酶激活进而诱导靶细胞发生焦亡

2020年4月17日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院邵峰实验室在《Science》杂志在线发表题为“Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells”的研究论文。该研究发现在细胞毒性淋巴细胞杀伤靶细胞的过程中，细胞毒性淋巴细胞来源的Granzyme A蛋白能够特异地高效激活Gasdermin B (GSDMB) 蛋白，从而导致靶细胞发生细胞焦亡，该分子机制能够促进机体抗肿瘤的免疫反应。

细胞毒性淋巴细胞是一类主要的免疫效应细胞，在机体清除病毒感染或者癌变的细胞过程中发挥着重要作用。细胞毒性淋巴细胞主要包括细胞毒性T细胞（CTLs）和自然杀伤细胞（NK细胞）。这两种细胞主要通过FAS/FASL通路和Perforin/Granzymes通路发挥细胞毒性作用，其中后者的作用更主要 (Voskoboinik et al., Nat Rev Immunol 2015)。然而，细胞毒性淋巴细胞是如何通过上述通路杀伤靶细胞以及靶细胞发生何种细胞死亡是免疫学领域的重要问题。从1990年开始，许多相关的研究表明FAS/FASL通路和Perforin/Granzymes通路导致细胞发生凋亡 (Russel et al., Annu Rev Immunol 2002)。但是这种结论的得出是由于当时细胞死亡的研究处于起步阶段，细胞凋亡往往被认为是最主要的细胞死亡方式，以及当时检测细胞死亡的方式不够准确等原因造成的。随后的研究表明靶细胞不仅仅通过apotosis的方式死亡，而且靶细胞以何种方式死亡和靶细胞的类型高度相关。例如当NK细胞杀伤CHP134细胞时，靶细胞会发生necrosis，而杀伤Jurkat细胞时，靶细胞则是apoptosis和necrosis混合。所以在效应细胞杀伤靶细胞的过程中，细胞死亡的重要分子机制还有待阐明。

细胞焦亡（pyroptosis）是一种促炎性的细胞死亡，最初认为是机体拮抗和清除病原菌感染的机制，需要半胱氨酸蛋白酶caspase1/4/5/11的激活。2015年邵峰实验室的突破性工作证实Gasdermin蛋白家族是细胞焦亡的直接执行蛋白 (Shi et al., Nature 2015)，细胞焦亡的准确定义也因此重新定义为由Gasdermin蛋白介导的程序性坏死 (Shi et al., TiBS 2017)。邵峰实验室后续的工作表明活化的caspase1/4/5/11能够切割Gasdermin D (GSDMD)的linker区，释放出具有打孔活性的N端结构域，最终导致细胞焦亡(Ding et al., Nature 2016)。接着，邵峰实验室2017年的研究发现caspase3能够激活Gasdermin E（GSDME），导致细胞焦亡的发生以及大多数的肿瘤细胞通过沉默GSDME逃避细胞死亡，首次将Gasdermin蛋白与肿瘤联系在一起 (Wang et al., Nature 2017)。而邵峰实验室在上个月的最新研究通过在肿瘤原位可控激活细胞焦亡，首次揭示细胞焦亡可高效诱导机体产生抗肿瘤免疫活性 (Wang et al., Nature 2020)。因此，Gasdermin蛋白家族是否在细胞毒性淋巴细胞杀伤靶细胞过程中发挥着重要作用是一个有趣且重要的问题。

为此，研究人员构建了NK细胞杀伤293T细胞的杀伤实验体系。研究人员在293T细胞中分别过表达GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD和GSDME，发现当细胞过表达GSDMB，在杀伤实验过程中靶细胞会发生细胞焦亡。而这个过程中的细胞焦亡不能够被pan-caspase inhibitor Zvad抑制，却能够被pan-serine protease DCI和EGTA抑制，说明NK细胞中的granzymes参与其中。通过western blot分析，研究人员发现GSDMB被切割成了30KD的N端和16KD的C端，说明Granzyme蛋白激活了GSDMB。

为了找到发挥作用的Granzyme蛋白，研究人员纯化得到了具有活性的5种人类Granzymes（A,B,H,K,M）,通过GSDMB的体外切割实验，发现Granzyme A (GZMA)特异地高效切割GSDMB，产生30KD和16KD的片段。随后研究人员通过Edman测序，找到了GZMA在GSDMB上的切割位点：第244位和229位的赖氨酸（Lysine）。通过点突变实验证明Lys244是最主要的切割位点。通过Liposome leakage实验证明了GZMA切割的GSDMB具有打孔活性，能够导致细胞焦亡的发生。

为了验证GZMA在细胞内的作用，研究人员通过电转的方法将具有活性的GZMA蛋白转到细胞内部，证实了GZMA能够导致GSDMB阳性的细胞发生剧烈的细胞焦亡，而当细胞的GSDMB基因被敲除后，则不会发生细胞焦亡。为了进一步证明GZMA-GSDMB通路在细胞毒性淋巴细胞发挥细胞毒性过程中的重要作用，研究人员采用了NK细胞杀伤实验体系和CTLs细胞杀伤实验体系进行实验，通过siRNA敲低GZMA，证明了GZMA-GSDMB通路在细胞毒性过程中发挥着重要作用。此外，研究人员还发现，IFN-a，IFN-b，IFN-y和TNF-a能显著上调GSDMB的表达量，其中IFN-y能够广泛地上调多种细胞的GSDMB表达，增加靶细胞被杀伤的敏感性。

已知细胞毒性淋巴细胞在肿瘤的清除中很重要，研究者验证GZMA-GSDMB通路在机体抗肿瘤的免疫过程中是否发挥作用。研究者在结肠癌细胞系CT26细胞中过表达Vector，GSDMB WT和GSDMB K244A K229A mutant（GSDMB KK/AA）,通过皮下注射的方式接种肿瘤细胞，在接种细胞后的第8天，11天和14天腹腔注射anti-PD1。最终研究人员发现，CT26-GSDMB WT的肿瘤在接受anti-PD1治疗后几乎完全消褪，而CT-26 Vector和CT26 GSDMB KK/AA的肿瘤则只有部分缩小。此外，研究人员在黑色素瘤细胞系B16F10细胞的肿瘤模型中也得到了类似的结果。通过这些肿瘤实验，研究人员证实了GZMA-GSDMB通路在机体抗肿瘤的免疫过程中发挥着重要作用。

综上所述，这项系统的研究工作，在国际上首次揭示了GZMA-GSDMB的通路在细胞毒性淋巴细胞杀伤靶细胞过程中的重要作用，激活的淋巴细胞能够通过释放IFN-y增强这一通路，实现正反馈。此外，这项研究证实了GZMA-GSDMB通路在机体的抗肿瘤免疫过程中的重要作用，为肿瘤免疫提供了新思路。

邵峰实验室的博士后周志伟和何华斌是本文的共同第一作者，该论文的其他作者还包括邵峰实验室的王坤，史旭焱，王玉鹏博士，苏娅，李达，刘旺博士和丁璟珒博士，解放军总医院的韩为东博士和王瑶为本研究提供了anti-CD19 CAR-T细胞，亘喜生物科技有限公司的沈连军博士和张永亮博士为本研究提供了NYESO-1 TCR-T细胞，北京肿瘤医院的沈琳博士为本研究提供了临床病理样品。邵峰博士为本文的通讯作者。该研究由国家自然科学基金委基础科学中心项目(81788104)、国家重点研究开发项目(2017YFA0505900，2016YFA0501500)和中国科学院战略重点研究项目(XDB08020202)资助，在北京生命科学研究所完成。