Nature | 邵峰/刘小云团队揭示病原菌抑制宿主细胞焦亡的新机制

早在上世纪八九十年代，人们便观察到细菌毒素刺激或细菌感染的巨噬细胞会发生裂解性的细胞死亡(1, 2)，起初人们认为这种细胞死亡是细菌主动诱导产生以破坏宿主免疫系统的一种现象，是细菌毒力的体现，并将其误认为是“细胞凋亡”或者“坏死”。近年来随着研究的深入，人们逐渐认识到这是一种新型的由细胞自主控制的程序性死亡方式——焦亡（pyroptosis）。

脂多糖（lipopolysaccharide/LPS，又称内毒素）是革兰氏阴性细菌外膜的关键成分，邵峰院士团队此前的工作表明人的caspase-4/5和小鼠中的同源蛋白caspase-11可识别胞质中的LPS，发生自剪切依赖的激活，并进一步切割活化GSDMD，GSDMD蛋白的N端结构域寡聚并插入细胞膜打孔，从而导致细胞焦亡的发生(3-6)。越来越多的证据表明，LPS–caspase-4/11–GSDMD通路所介导的细胞焦亡在宿主抵抗革兰氏阴性病原菌的免疫防御中发挥着至关重要的(7)。

非经典炎症小体通路

志贺氏菌属（Shigella，又称痢疾杆菌）是引起人类细菌性痢疾（shigellosis）的常见病原菌，它能以极高的效率突破免疫防御并引起出血性腹泻和严重的肠道炎症。感染发生时，志贺菌会侵入宿主细胞，迅速逃离介导入侵的膜泡并在胞质内自由地生长繁殖。作为一种革兰氏阴性菌，这一特殊的生活方式不可避免地使其LPS暴露于caspase-4/11的免疫监视之下。然而，caspase-4/11介导的细胞焦亡在抵抗志贺菌感染中所发挥的功能并不清楚。漫长的共进化过程中，志贺菌又是否获得了对抗caspase-4/11的法宝呢？

2021年10月20日，北京生命科学研究所邵峰实验室和北京大学基础医学院刘小云实验室在 Nature 上合作发表了题为 Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11 的研究成果。该研究发现福氏志贺菌（Shigella flexneri）通过分泌效应蛋白OspC3介导一种全新的翻译后修饰来抑制caspase-4/11的功能，避免宿主细胞焦亡的发生，从而逃逸了这一重要的天然免疫防御机制对细菌的识别和清除。

研究伊始，邵峰实验室的研究人员发现，在给小鼠感染伯克霍尔德菌（也是一种在胞质中生活的革兰氏阴性病原菌）时，野生型小鼠可以存活下来，但Casp11敲除的小鼠很快就死亡了，确认了caspase-11对于抵抗革兰氏阴性菌的重要作用。然而非常意外的是，在志贺菌感染时，两种小鼠却没有表现出明显差异。

（左：感染志贺菌；右：感染伯克霍尔德菌）

作者通过体外细胞感染模型也发现，伯克霍尔德菌和沙门氏菌 （均为胞内革兰氏阴性菌）可以显著激活caspase-4/11–GSDMD通路介导的焦亡，然而志贺菌感染时却几乎观察不到这一现象。这提示志贺菌可能通过某种方式抑制了caspase-4/11–GSDMD通路的激活。

先前的研究表明，志贺菌可通过其三型分泌系统释放一些效应蛋白来抑制或影响宿主细胞的多种信号通路。作者对这些效应蛋白进行了分析和筛选，发现敲除了ospC3的志贺菌（S. f. ΔospC3）可显著诱导caspase-4/11依赖的GSDMD的切割以及细胞焦亡的发生，提示志贺菌可能通过分泌OspC3来抑制LPS诱导的细胞焦亡。

那么，OspC3是通过什么机制来发挥作用的呢？

首先，作者发现，在宿主细胞中外源表达OspC3即可抑制LPS诱导的GSDMD的切割以及细胞焦亡的发生，表明志贺菌感染时的确是分泌的OspC3本身抑制了caspase-4/11的功能，并且OspC3行使功能时不依赖于细菌中的其他因子。

进一步地，作者发现OspC3可以与caspase-4/11发生相互作用。然而，将重组表达的OspC3与caspase-4/11进行体外孵育时，OspC3并不能抑制caspase-4/11对GSDMD的切割，但将同样的OspC3蛋白转入细胞后，LPS诱导的焦亡被抑制了。这表明OspC3不是简单地通过结合作用来抑制caspase-4/11的功能，而是需要细胞内某种因子的参与才能发挥作用。

作者注意到，在SDS-PAGE凝胶上，与OspC3共表达的caspase-4迁移速率变慢，非变性胶上也可观察到条带位置发生显著变化，这一数据表明，与OspC3共表达后，caspase-4/11蛋白上很可能发生了某种翻译后修饰。

电喷雾电离质谱（ESI-MS）和碰撞诱导解离质谱（CID-MS）分析显示，与OspC3共表达可使caspase-4/11的分子量增加524道尔顿（Da）。然而令人疑惑的是，524 Da的质量与任何已知的翻译后修饰都不匹配。

这一出乎意料的现象愈发激起了作者们的研究兴趣。作者对发生修饰的肽段进行二级串联质谱分析，发现了质量与腺苷、单磷酸腺苷（AMP）和二磷酸腺苷（ADP）相匹配的离子。这让作者联想到了一种广泛存在的翻译后修饰：ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）。在这种修饰中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作为供体，其中的ADP-核糖（ADPR）基团被转移到氨基酸残基的侧链上，使其分子量增加541 Da。

ADP-核糖基化示意图（但今天的故事远没有这么简单）

作者发现，在NAD⁺存在的情况下，纯化的OspC3蛋白可在体外重组反应中重现共表达条件下对caspase-4/11的修饰，这证明OspC3就是直接催化该翻译后修饰的酶，并且这种修饰的供体也是NAD⁺。然而，OspC3介导的修饰比ADP-核糖基化小了17 Da （524 Da vs. 541 Da），证明这一修饰与ADP-核糖基化并不相同。

进一步地，作者通过电子转移/高能碰撞解离质谱（EThcD-MS）分析发现，524 Da 的修饰分别发生在caspase-4 第314位或caspase-11第310位的精氨酸残基上 （R314/R310），将R314/R310突变为赖氨酸或天冬酰胺后，修饰不再发生。

至此，一个崭新的科学问题摆在作者面前：利用NAD⁺作为供体，如何给精氨酸残基加上524 Da的修饰？

精氨酸残基	NAD+的化学结构

通过分析多种NAD⁺ 类似物进行体外修饰反应的结果，作者证明，NAD⁺中的ADP-核糖基团被转移到了底物蛋白上，同时释放了烟酰胺，定量的高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析也证明修饰反应的确释放了烟酰胺。这与已知的ADP-核糖基化的过程一致。那么，减小的17 Da源自何处呢？从分子量上分析，减小17 Da很可能是由于发生了脱氨反应，而可能的脱氨位点只有两个：腺苷上的氨基和精氨酸侧链的氨基。

首先，作者检测了修饰反应后的产物，发现的确产生了氨。作者又利用一种焦磷酸键水解酶NUDT16与修饰后的caspase-4反应，发现成功地从修饰中去除了一个完整的AMP基团，证明在该修饰中AMP部分是保持不变的，这也表明脱去的氨基应该就是精氨酸侧链的氨基。的确，利用已经脱氨的NAD⁺（Deamino-NAD⁺）进行修饰反应时，从分子量变化分析也存在脱氨反应。至此，一切证据都指向精氨酸侧链在修饰中发生了脱氨。如何才能直接证明这一点呢？作者创造性地利用稳定同位素氨基酸标记 （SILAC）结合质谱分析的方法，发现修饰后的精氨酸残基失去了一个氮原子（N），为精氨酸残基上发生的脱氨反应找到了直接证据。至此，作者证明了OspC3介导的修饰反应实质上由精氨酸残基的ADP-核糖基化和脱氨组合而成（+541-17 = 524 Da）。

那么这个脱氨反应是如何发生的呢？从化学角度分析，脱氨需要一个靠近精氨酸侧链的亲核基团发动进攻，使氨基离去。作者推测核糖基团的2’-OH可能扮演了这一角色，于是他们合成了2’-OH被氢原子替代的 NAD⁺类似物 （2’-Deoxy-2’-H-NAD⁺），并用其进行了体外修饰反应。实验结果表明，2’-OH亲核基团的丧失，使修饰反应停留在ADP-脱氧核糖基化，不再能发生脱氨。所以，在OspC3介导的修饰中，核糖基团的2’-OH发动亲核进攻取代了精氨酸侧链的氨基。

然而，此时的信息依然不足以明确这种修饰的化学结构，因为理论上精氨酸侧链的三个N都可以接收ADP-核糖基团，而ADP-核糖基化发生的位置决定了这个修饰最终的化学结构。为了得到准确的答案，作者利用一种小分子茚三酮 （ninhydrin）可以与精氨酸侧链末端氮原子发生反应的特性，证明了δ位的氮原子（N^δ）接收了ADP-核糖基团。

通过一系列设计精妙的生化实验和严密的逻辑推理，作者最终发现OspC3通过催化两步亲核取代反应，实现利用NAD⁺对caspase-4/11-R314/R310的共价修饰（建议感兴趣的读者阅读原文）。首先，精氨酸上的N^δ对NAD⁺中的烟酰胺进行亲核取代，这与目前已知的精氨酸ADP-核糖基化（发生在N^ω上）是不同的。随后，ADP-核糖基团的ribosyl-2’-OH被活化，进攻精氨酸侧链末端胍基的碳原子，引发脱氨反应，从而在脱去一个氨基的精氨酸和ADP-核糖基团之间形成一个恶唑烷环 （oxazolidine）的共价连接结构。作者将这种全新的修饰命名为ADP-riboxanation，并据此将OspC3的活性定义为精氨酸ADP-riboxanase。

那么，为何发生了ADP-riboxanation的caspase-4/11不再能介导细胞焦亡呢？

作者发现，OspC3首先阻断了LPS诱导的caspase-4/11的自切割，从而抑制了caspase-4/11的活化。此外， OspC3也可以对已经活化的caspase-4/11进行修饰，从而干扰caspase-4与GSDMD的结合位点，使其不再能与GSDMD形成稳定的蛋白复合体。修饰后的caspase-4/11失去了结合和切割GSDMD的能力，同时也失去了切割其最适多肽底物的能力。通过对caspase家族的蛋白序列进行比对分析，作者发现修饰发生的R在所有caspase家族成员中都是保守的，将caspase-4/11 的 R314/310突变为赖氨酸、丙氨酸或谷氨酸均可使其失活。因此，R314/310 ADP-riboxanation破坏了caspase-4/11蛋白酶关键位点的生化特性，使它们丧失了基本的切割多肽的功能。

研究清楚对底物caspase-4/11的修饰机制后，作者又将目光转回到酶本身——作为精氨酸ADP-riboxanase，OspC3是如何识别底物蛋白并发挥功能的呢？

福氏志贺菌共编码三个OspC家族蛋白：OspC1、OspC2和OspC3。尽管这三个蛋白的序列一致性超过60%，但与OspC3不同的是，OspC1/2几乎不修饰caspase-4，也不能抑制LPS诱导的细胞焦亡。基于序列分析的结构预测表明它们均包含一个位于C端的ankyrin repeats domain（ARD，介导蛋白质间的相互作用）和一个未知功能的N端结构域。

作者进一步发现，OspC3的ARD，而不是OspC1/2的ARD，能够与caspase-4发生相互作用。将OspC3的ARD替换为OspC1/2的ARD，几乎完全去除了其对caspase-4的修饰功能。相反，将Ospc1/2的ARD 替换为OspC3的ARD后，它们也可以高效地修饰caspase-4并抑制LPS诱导的细胞焦亡。因此，OspC3的ARD结构域决定了其对底物caspase-4/11的识别，并且提示OspC家族蛋白都具备保守的ADP-riboxanase活性，并以ARD结构域的多样性实现对不同底物蛋白的选择。

作者通过大量的突变筛选发现了多个OspC3发挥修饰功能的关键残基，均位于其N端的酶活结构域内且在OspC家族中高度保守。值得一提的是，D177A的突变导致OspC3介导的修饰停留在ADP-核糖基化，阻止了随后的脱氨反应，这对上文中经推理分析得出的两步亲核取代的反应机制提供了强有力的佐证。D177A-OspC3介导的修饰可被细胞中的精氨酸ADP-核糖基水解酶去除，但ADP-riboxanation抵抗了所有已知的ADP-核糖基水解酶的去修饰作用。因此，通过ADP-riboxanation来抑制caspase-4/11对细菌来说更为有利。

（上：ADP-riboxanation；下：ADP-ribosylation）

最后，作者回到动物模型上，对OspC3在志贺菌感染过程中的生物学意义进行了更加深入的解析。

作者发现，在野生型志贺菌致死剂量的感染条件下，野生型小鼠在感染OspC3活性缺失的菌株后可以存活。然而，Casp11敲除小鼠对野生型和ospC3敲除的菌株同样敏感。对小鼠器官的细菌负荷量进行检测也得到了类似的结论。这些结果表明Ospc3介导的caspase-11的失活在志贺菌逃逸宿主免疫防御中具有关键作用。

值得注意的是，与感染野生型志贺菌的小鼠相比，感染ospC3敲除菌株的小鼠产生了更多抗志贺菌的抗体，且在面临再次感染时表现出更强的抵抗力，而这一现象在Casp11或Gsdmd敲除的小鼠中并不存在。这一发现揭示了caspase-11介导的细胞焦亡对激活适应性免疫也起一定作用。据此，作者发现ospC3的敲除可以作为一种潜在的志贺菌减毒活疫苗的开发策略。

最后，作者还发现OspC家族蛋白在多种细菌中存在，这提示ADP-riboxanation修饰可能被广泛应用于多种生物学场景。

综上所述，该研究发现了一种由OspC家族蛋白介导的新型翻译后修饰——精氨酸ADP-riboxanation。志贺菌分泌效应蛋白OspC3对caspase-4/11的R314/310进行修饰，阻断了caspase-4/11的活化及其对GSDMD的切割，抑制了LPS诱导的细胞焦亡，从而逃逸了caspase-4/11–GSDMD所介导的宿主抗胞内革兰氏阴性菌的免疫机制。该研究不仅揭示了志贺菌——这一重要的肠道病原菌如何逃逸宿主的天然免疫系统，也开辟了蛋白质翻译后修饰领域一个全新的研究方向，堪称邵峰团队在宿主和病原菌相互作用领域又一里程碑式的工作。

邵峰实验室李子霖博士为本文第一作者。邵峰实验室刘旺博士，刘小云实验室付嘉琦博士以及中科院生物物理所丁璟珒博士亦为本工作做出重要贡献。论文的其他作者还包括程森博士，许悦博士，王志强，刘筱璠，史旭焱，刘亚鑫和齐湘兵博士。邵峰博士和刘小云博士为本文共同通讯作者。该研究由科技部国家重点研发计划，中科院战略先导科技专项，国家自然科学基金，以及中国医学科学院医学与健康科技创新工程资助，在北京生命科学研究所完成。

参考文献

1. A. M. Friedlander, Macrophages Are Sensitive to Anthrax Lethal Toxin through an Acid-Dependent Process. J Biol Chem 261, 7123-7126 (1986).

2. A. Zychlinsky, M. C. Prevost, P. J. Sansonetti, Shigella flexneri induces apoptosis in infected macrophages. Nature 358, 167-169 (1992).

3. J. Shi et al., Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature 514, 187-192 (2014).

4. J. Shi et al., Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526, 660-665 (2015).

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7. V. A. K. Rathinam, Y. Zhao, F. Shao, Innate immunity to intracellular LPS. Nat Immunol 20, 527-533 (2019).