Nature | 邵峰实验室与丁璟珒课题组合作揭示非经典炎症小体通路识别和活化炎症因子IL-18的分子机制

2023年11月23日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院邵峰实验室与中科院生物物理所丁璟珒实验室合作在Nature上在线发表了题为“Recognition and maturation of IL-18 by caspase-4 noncanonical inflammasome”的研究论文。该研究发现白介素-18(IL-18)是半胱氨酸蛋白酶caspase-4/5的底物蛋白，并解析了caspase-4与IL-18复合物的精细三维结构，详细阐明了caspase-4/5特异识别和切割IL-18的分子机理。

邵峰实验室的研究人员发现, caspase-4与其底物蛋白GSDMD在众多非免疫细胞系中表达，在这些细胞中，caspase-4同样能够识别革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)，进而切割活化膜打孔蛋白GSDMD，诱导细胞发生焦亡。除了caspase-4与GSDMD，作者发现IL-18前体蛋白(Pro-IL-18)也在众多非免疫细胞系中广泛表达，但是已知的能够加工Pro-IL-18的上游蛋白caspase-1却只在少数细胞中表达。Pro-IL-18与caspase-1表达谱上的巨大差异提示细胞内可能存在caspase-1以外的蛋白酶能够加工Pro-IL-18。基于对于半胱氨酸蛋白酶家族的认识，作者猜想广谱表达的caspase-4可能具备加工Pro-IL-18的能力。

作者首先发现在细胞内由LPS激活的caspase-4能够高效地切割Pro-IL-18，切割产生的成熟形式IL-18会伴随细胞焦亡释放到细胞外周中，进而发挥其作为经典促炎症细胞因子的生理功能。IL-18属于白介素1家族，该家族包含IL-1α，IL-1β，IL-18，IL-36，IL-37和IL-38，实验发现 caspase-4只能切割Pro-IL-18，表明是该切割事件是特异的。并且非经典炎症小体通路活化IL-18的现象并不是人类所特有的，其它高等哺乳动物（如猪、兔子等）的caspase-4被LPS激活后也能介导相应物种的Pro-IL-18加工和活化。

在体外实验上，重组表达的活性形式caspase-4能够高效地切割Pro-IL-18，其酶切效率与caspase-1相当。caspase-4与caspase-1都切割在Pro-IL-18第36位天冬氨酸后的肽键上，并且该切割完全依赖Pro-IL-18中33位到36位的四肽序列LESD，四肽序列的突变将会使caspase-4完全不能切割Pro-IL-18。有趣的是，小鼠的Pro-IL-18同样具备四肽序列LESD，但是人的caspase-4切割小鼠Pro-IL-18时十分低效，这个结果暗示除了四肽序列之外，caspase-4切割Pro-IL-18还需要另外的识别位点。

为了完整揭示caspase-4识别Pro-IL-18的分子机制，作者尝试解析caspase-4与Pro-IL-18复合物的晶体结构。然而经过多轮尝试，caspase-4与Pro-IL-18的复合物并没有成功长出晶体。这时，作者想到了痢疾杆菌(Shigella)分泌的效应蛋白OspC3，邵峰实验室前期的工作发现OspC3可以特异识别宿主细胞内的caspase-4，通过催化caspase-4酶活中心的关键精氨酸发生一种全新的ADP-riboxanation翻译后修饰进而使caspase-4失活^6,7。OspC3-C端保守的ankyrin-repeat结构域（ARD）能够与caspase-4的蛋白酶结构域相互作用，介导OspC3对capsase-4的特异识别，该caspase-4-p30–OspC3^ARD复合物的晶体结构已被成功解析⁶。作者发现加入OspC3^ARD不会影响caspase-4切割Pro-IL-18，因此可以利用OspC3^ARD来帮助稳定caspase-4与IL-18复合物，促进其结晶。通过加入OspC3^ARD，作者成功解析了OspC3^ARD-caspase-4-Pro-IL-18的三元复合物的高分辨率晶体结构。

该三元复合物以2:2:2的形式呈现，其中caspase-4-p20/p10二聚化形成四聚体，两端分别与Pro-IL-18相结合，而OspC3^ARD位于caspase-4-p20的侧面，起到稳定三元复合物的作用。在该高分辨率复合物结构中，Pro-IL-18的LESD四肽序列深入caspase-4的酶活中心，与caspase-4酶活中心结合，形成第一个作用界面。此外，caspase-4-p20-C末端的loop区和另一个caspase-4-p10-N端的loop区形成一个分子间的β折叠，这个β折叠独立于caspase的酶活中心，与Pro-IL-18结合，构成第二个相互作用界面。Caspase-4 通过这两个相互作用界面来识别IL-18，任意突变其中一个都会使caspase-4无法特异识别Pro-IL-18。此外，值得一提的是caspase-4的这个β折叠同样也是caspase-4识别GSDMD所必需的，表明该底物识别位点具有保守性。除了Caspase-4，LPS激活的caspase-5与经典炎症小体所激活的caspase-1在识别Pro-IL-18时同样需要这两个相互作用界面，表明这个识别机制是caspase-1/4/5加工Pro-IL-18所共有的。

图1：OspC3^ARD-caspase-4-Pro-IL-18三元复合物的分子结构

OspC3ARD-caspase-4-Pro-IL-18的三元复合物首次展示了Pro-IL-18的精细晶体结构，令人意外的是，Pro-IL-18与成熟形式IL-18在结构上存在众多不同之处，并不是原来预期的在成熟形式IL-18-N端前面简单加上36个氨基酸的肽段。Pro-IL-18在被caspase-1/4/5切割后，其构象会发生巨大的变化，重新折叠产生新的β发卡与α螺旋结构，而这些新产生的二级结构对于IL-18结合其受体IL-18Rα至关重要，是IL-18发挥生理功能所必需的。这个结果也从结构层面解释了pro-IL-18无法结合IL-18Rα的原因。

作者还发现，无论是在小鼠原代巨噬细胞中还是体外重组蛋白切割实验中，小鼠的caspase-11都不能切割鼠的Pro-IL-18。在炎症小体研究领域，人们往往使用小鼠作为实验对象与工具，这也是caspase-4-IL-18这条通路长期未被发现的原因之一。通过结构比对发现，caspase-4识别Pro-IL-18的关键残基在caspase-11上不保守，将caspase-11上关键残基突变与替换后，可以使其具备与caspase-4相当的加工Pro-IL-18的能力。这个结果也从侧面证明了caspase-4-Pro-IL-18复合物结构的准确性。

综上所述，这项工作发现非经典炎症小体通路下的caspase-4/5具备切割加工Pro-IL-18的能力，caspase-4/5-IL-18这条通路在众多种类细胞中存在，丰富了人们对于细胞焦亡这一天然免疫机制的认识。这项工作首次展示了caspase-4 与Pro-IL-18复合物的精确三维结构，为caspase的酶活机制与底物识别机制研究提供了新的理解。在临床上，血液中高水平的IL-18与多种自身免疫疾病相关，如特异性皮炎，炎症性肠病和幼年特发性关节炎，LPS-caspase-4/5-IL-18这条通路的发现为这些自身免疫疾病的发生以及开发新的干预策略提供了全新的思路。

图2：Caspases特异识别与切割IL-18的精确分子机制

邵峰实验室的史旭焱博士与中科院生物物理研究所丁璟珒课题组博士生孙启超为本文共同第一作者。论文的其他作者还包括生物物理研究所丁璟珒课题组的侯彦婕博士，邵峰实验室的曾欢博士，董梦秋实验室的曹勇博士和董梦秋博士。邵峰博士和丁璟珒博士为本文的共同通讯作者。该研究由中科院战略先导科技专项，国家自然科学基金基础医学中心项目，国家重点研究开发项目，中国医科院创新医学单元项目，以及腾讯新基石研究员项目资助，在北京生命科学研究所与中科院生物物理研究所完成。

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