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Nature | 张二荃实验室证明调控昼夜节律的核心组分RUVBL2是真核生物钟的共同起源分子
导读 ⭐
Introduction
昼夜节律广泛存在于地球上的生物体中，是生物体预知并响应环境的昼夜变化的重要机制。昼夜节律在维持生理稳态和人体健康中发挥着关键作用，其紊乱可能引发睡眠障碍、肥胖、免疫力下降等疾病，并增加癌症及精神疾病的风险，对人类健康构成严重威胁。
生物钟是昼夜节律的分子机制，以转录-翻译负反馈环路(transcription–translation feedback loop, TTFL)的形式发挥功能。TTFL模型是20世纪90年代提出的，目前在不同生物钟系统中得到了广泛应用。然而，随着研究的深入，TTFL理论面临诸多挑战。例如，尽管真核生物的生物钟架构高度相似，但核心组分却存在显著差异。例如，植物缺乏与动物PERIOD蛋白相似的生物钟成分，这表明当前发现的TTFL机制可能无法解释真核生物钟系统的共同起源。此外，仅依赖高能耗的转录和翻译过程，或许难以支撑长达24小时的节律振荡。而从结构生物学角度来看，迄今仍无法在真核生物体外重建类似蓝藻PTO系统的24小时TTFL振荡。这些证据均指向一个核心问题：单靠TTFL机制，难以解释真核生物钟的起源及其24小时震荡的维持，因此昼夜节律的调控机制仍需进一步探索。
2025年3月26日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院张二荃实验室在《Nature》发表题为“The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes”的研究论文。该研究在其团队2020年发表于《Science Translational Medicine》的论文“Chemical perturbations reveal that RUVBL2 regulates the circadian phase in mammals”基础上，进一步揭示了RUVBL2作为真核生物钟的共同核心成分，并支持了最初在蓝藻中发现的“缓慢ATP酶活性是生物钟共同特征”的观点。
在2020年的研究中，张二荃实验室发现RUVBL2——一种低水解活性的AAA+ ATPase，在哺乳动物的生物钟复合物(mega-dalton super-complex)中发挥关键作用，并调控昼夜节律的相位与振幅。然而，由于周期通常被认为是衡量昼夜节律功能更可靠的参数，而此前的研究缺乏直接证据表明 RUVBL2 参与周期调控，因此 RUVBL2 是否为核心生物钟组分仍存在争议。为了弥补这一缺陷，该研究团队利用CRISPR/Cas9介导的高通量筛选技术，对近1000个RUVBL2敲入突变体进行全面分析。实验结果表明，在人类U2OS细胞中，多个RUVBL2突变体呈现短周期、长周期或无节律的不同表型。这种通过靶向单一基因即可同时调控振幅、相位，并引起双向周期变化的现象，仅在少数核心生物钟基因(例如果蝇的Per和蓝细菌的kaiC)中被观察到。此外，RUVBL2的表达具有节律性、可被环境因子调节，并且其敲除会导致无节律表型，进一步证明了RUVBL2是生物钟的核心成分(图1)。
图1：RUVBL2是生物钟的核心组成成分(改编自原文)
(a) 在细胞中敲入突变会导致长周期、短周期或无节律的表型，而在小鼠SCN过表达RUVBL2突变体可重现长周期和短周期的节律变化。此外，细胞与小鼠的周期表型呈线性相关。
(b) 在小鼠SCN中敲除Ruvbl2会导致其在恒定黑暗条件下丧失活动节律。
为了探究RUVBL2如何影响生物钟周期，研究团队对突变位点进行了深入分析，发现这些突变主要集中在P-loop结构域——这一区域与ATP结合密切相关，提示RUVBL2可能通过ATP水解调控周期振荡。进一步实验显示，RUVBL2突变体的周期调节独立于TTFL复合物中的CRY，即便在CRY蛋白水平下降的情况下，周期表型仍然存在。这一发现表明RUVBL2可能通过不同于传统TTFL途径的方式影响生物钟周期。
更重要的是，研究人员测定了RUVBL2及其突变体的ATP水解酶活性，结果显示RUVBL2水解ATP的速度极慢，每24小时仅水解13个ATP分子。这一活性水平远低于典型AAA+ ATP 酶，但与蓝藻KaiC的ATP水解速率(每天15个ATP分子)相当。这种低活性可能是维持24小时周期震荡的基础。进一步分析发现，RUVBL2的ATP酶活性与细胞周期长度呈显著负相关——较高的ATP酶活性对应更短的周期，较低的活性对应更长的周期，正如蓝藻的KaiC一样。结合结构分析和定点突变，研究者们发现，与KaiC类似，RUVBL1/RUVBL2晶体结构口袋里的水分子处于不利于对ATP进行亲核攻击的位置，导致RUVBL1/RUVBL2的ATP酶活性极低。这一发现进一步凸显了RUVBL2与蓝藻KaiC在生物钟调节机制上的相似性，为揭示真核生物与原核生物生物钟系统的进化关联提供了有力证据(图2)。
图2：在人源RUVBL1/RUVBL2复合物的ATP结合口袋中，水分子的位置与蓝藻KaiC相似，都处在一种非优化的进攻ATP γ-磷酸基团的状态，因而决定了它们是一类极慢速的ATP水解酶。
RUVBL在真核生物中高度保守，其氨基酸序列相似性高达85%。通过梳理已有文献，研究者们发现RUVBL蛋白广泛分布于多种生物钟超复合物中，表明其可能与不同物种的核心生物钟成分存在潜在的相互作用。进一步结合免疫共沉淀和质谱分析，研究者们证实了RUVBL2的同源蛋白能够与哺乳动物、果蝇、拟南芥乃至粗糙脉胞菌的核心生物钟蛋白相互作用。此外，利用遗传学操作和药理学实验，研究人员发现RUVBL2在果蝇、拟南芥和粗糙脉胞菌中的同源蛋白也参与昼夜节律调控，并且其ATP酶活性与周期长度的关系与哺乳动物和蓝藻一致。这些证据进一步证实，RUVBL2作为保守的低活性ATP酶，在调节真核生物钟周期方面发挥了关键作用。
基于这些发现，研究团队提出了一个新的假设：在远古生命起源阶段，随着原始生物钟的出现，低活性的P-loop ATP酶成为生物钟系统的核心组件。蓝藻中，KaiC结合KaiA和KaiB组成了一个连接到TTFL的强大振荡器，而在真核生物中，含有P环的AAA+ ATP酶RUVBL2及其同源蛋白通过与TTFL生物钟蛋白相互作用，参与生物钟的调控。KaiC和RUVBL2极低的ATP酶活性共同决定了生物钟的24小时节律振荡，这一机制或许是生物钟系统进化的共同特征。
图3：艺术化呈现的生物钟起源模型(由徐占聪设计完成)
这个ATP酶驱动的沙漏隐喻了极慢的水解酶动力学决定了振荡的速度，促成了24小时的昼夜节律。背景中组成六聚体的RUVBL2是真菌、果蝇、植物和小鼠生物钟系统中的共同起源分子。
综上所述，本研究在之前的工作基础上，进一步证实了RUVBL2作为核心生物钟组分的作用，还揭示了其ATP酶活性如何以类似KaiC的机制调节真核生物的昼夜节律。这一发现丰富了真核生物钟的分子调节机制，并提出了低活性的ATP酶作为生物钟起源核心组分的进化假设，在进化生物学和生物钟研究领域具有重要意义。
北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院张二荃研究员为本文的通讯作者。张二荃实验室的博士生廖媚妹、刘艳琴、和徐占聪为本文的共同第一作者。圣地亚哥大学昼夜节律中心的Susan S. Golden教授和方明旭博士在蓝藻相关实验方面提供了重要支持，美国德克萨斯大学生物钟研究中心的Paul E. Hardin教授在果蝇实验中亦给予了关键帮助。重庆医科大学附属第二医院的鞠大鹏副研究员在该工作中提供了实验和技术指导。该工作还得到了北京生命科学研究所王涛实验室、蛋白质组中心和代谢组学中心的大力支持。研究过程中，还得到了国内诸多生物钟课题组的帮助：秦曦明、徐小冬、何群实验室分别提供了蓝藻、拟南芥、真菌的部分实验帮助；徐璎教授提供了有益的讨论建议；张勇、张珞颖、刘晓和马定邦提供了实验材料或数据库支持。Joseph S. Takahashi、Michael Rosbash、Steve A. Kay、John B. Hogenesch、Achim Kramer、Michael Brunner 教授以及Neuroscience Pioneer Club的成员提供了宝贵的建议。本研究获得了中国国家重点研发计划（2024YFA1803200）、STI2030重大专项（2021ZD0203400）、北京市政府、清华大学，及美国NIH/NIGMS的资助。
论文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-025-08797-3
DOI：10.1038/s41586-025-08797-3
