董梦秋课题组与中科院计算所pFind研究团队合作发表了题为“Mapping Native Disulfide Bonds at a Proteome Scale”的研究论文。

2015年2月9日，董梦秋课题组与中科院计算所pFind研究团队合作在《Nature Methods》在线发表了题为“Mapping Native Disulfide Bonds at a Proteome Scale”的研究论文(doi:10.1038/nmeth.3283)。该文章报道了两套分别适用于简单和复杂样品的高效鉴定蛋白二硫键的质谱方法。

蛋白质鉴定和结构功能分析是现代生物学研究中的必要环节，而质谱已成为这一环节的支撑技术。很多定位到细胞表面或分泌到胞外的蛋白质都有二硫键，例如免疫系统产生的抗体、各类生长因子（growth factors）、内分泌系统产生的肽激素如胰岛素，以及这些生长因子或激素的受体。因为二硫键的正确形成对于这些蛋白质的稳定性和活性至关重要，而且很多蛋白质药物以及生物制药的靶蛋白都有这些属性，所以二硫键配对状态的精确解析对于它们的结构功能研究和相关药物的研发、质控有重要价值。但是，以往的蛋白质二硫键定位方法，例如点突变、分步还原加差异烷基化处理、依赖手工解谱的质谱方法等等，不仅繁琐耗时，灵敏度低，而且仅适用于单个纯化蛋白。

在这篇论文中，作者开发了可以从复杂样品中精确解析蛋白质二硫键结构的高通量质谱方法，包括克服蛋白质二硫键体外交换、保持其天然结构的样品制备方法，二硫键交联肽段的最优质谱分析方法，以及配套的二硫键鉴定软件pLink-SS。其中，pLink-SS是作者在之前的合作成果pLink软件 (Yang B. et al., Nature Methods, 2012)的基础上开发的。pLink用于鉴定化学交联肽段，在蛋白质复合体的组装和蛋白质相互作用的界面的研究中发挥着越来越多的作用。针对二硫键的鉴定问题，作者利用合成多肽构建了上千对二硫键交联肽段，通过由此产生的标准数据集修改、优化pLink，开发出了pLink-SS。采用这套完整的二硫键分析流程，作者正确解析了一个单克隆抗体的全部11对二硫键，包括位于轻、重链可变区，事先不确知位点的两对二硫键，以及十个标准蛋白混合物中所含有的全部74对二硫键。另外，作者还从大肠杆菌的膜周质组分，A549人源肺腺癌肺泡上皮细胞的全细胞裂解液，以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 的分泌蛋白中分别鉴定到了199，334和568对二硫键。这是目前最大规模的蛋白质二硫键组学研究。为了验证结果的可靠性，作者重组表达了八个新发现的含有二硫键的大肠杆菌蛋白，用不同的质谱方法在蛋白和肽段水平验证了这八个蛋白的全部9对二硫键，其中包括细菌群体感应(quorum sensing)信号分子AI-2的合成酶LuxS上的一对分子间二硫键。最后，作者将二硫键组学分析和半定量质谱方法结合起来，寻找革兰氏阴性菌中催化蛋白质二硫键形成的酶DsbA的底物，验证了14个有文献报到的DsbA的底物，并发现了30个新的DsbA的底物。从上述组学研究结果中，作者发现了不少对氧化还原状态敏感的、有调节功能的蛋白质二硫键。

董梦秋课题组的博士生卢珊、中科院计算所的博士生樊胜博以及董梦秋实验室以前的博士生杨兵为本文共同第一作者。其他作者还包括董梦秋实验室的李玉欣、张美俊，中科院计算所的孟佳明、邬龙、张昆、孙瑞祥博士和贺思敏博士，北京大学的罗金才博士和学生李品，以及中科院数学所的付岩博士。董梦秋和贺思敏为共同通讯作者。这项研究得到了科技部国家重大科学仪器设备开发专项、973项目、国家自然科学基金和北京市政府的资助。