张志远实验室与王晓东实验室合作研发了新型MLKL蛋白抑制剂

2017年4月4日，我所张志远实验室与王晓东实验室合作在《Chemical communications》发表题为“Discovery of a new class of highly potent necroptosis inhibitors targeting the mixed lineage kinase domain-like protein ”的研究论文。作者成功研发了一种新型、高活性作用于MLKL蛋白的抑制剂，为该靶标的成药性奠定了基础，该文章的艺术配图被选为当期CC封面。

Explanation of the cover artwork: RIP1，RIP3 and MLKL are sequentially activated during the programmed cell necroptosis pathway , MLKL is the executioner. A highly potent small molecule (TC013-172) inhibits the action of MLKL ,and efficiently rescues dying cells.

细胞程序化坏死是近期生物领域的一项重大发现，王晓东实验室以及世界其他研究小组的研究成果近年揭示了RIP1，RIP3和MLKL是这一细胞坏死通路重要信号蛋白，其中MLKL的寡聚上膜造成细胞膜的破损导致细胞坏死。细胞坏死与炎症相关的疾病和神经系统的疾病密切相关，以细胞坏死通路作为靶标进行相关抑制剂的研发具有重要的临床应用价值。目前，细胞坏死抑制剂的研发主要集中在开发RIP1激酶抑制剂，RIP1作为激酶蛋白可以建立完善的体外激酶高通量筛选体系获得先导化合物。而MLKL蛋白作为RIP3的下游和细胞坏死的执行者，其本身不具有激酶活性，MLKL抑制剂是基于抑制自身蛋白相互作用而导致的寡聚过程，体外筛选模型的建立比较困难，开发基于MLKL靶向性的抑制剂极具挑战性。

张志远实验室一直从事药物研发和开发靶标鉴定新方法方面的的工作，而王晓东实验室一直致力于细胞坏死机制的研究。两个实验室合作利用TNFα，zVAD和Smac mimetic诱导HT-29细胞坏死的高通量筛选模型，对20万化合物分子库进行筛选，获得了几种可以有效抑制细胞坏死的候选化合物。继两个实验室共同开发了高活性，高选择性的RIP1激酶抑制剂RIPA-56之后（Ren Y, J. Med. Chem,2017），这次又成功地开发出高活性MLKL细胞坏死抑制剂。

本文章以一个抑制细胞坏死高通量筛选先导化合物1（EC₅₀=390 nM）为基础。首先验证其对RIP1和RIP3激酶活性没有抑制作用，推断其可能作用在MLKL蛋白或更下游未知的靶标蛋白。作者所采用的策略是以化合物1作为起始点进行了一系列药化手段提高化合物的活性、建立构效关系。其目的，一是探索靶向的成药性， 二是利用构效关系来设计高质量小分子探针来更准确、有效进行靶标的鉴定。最终，获得了高活性的化合物TC13-172 （EC₅₀=2 nM），与初始化合物1相比，抑制细胞坏死的活性提高了200倍。

同时，基于所建立的构效关系，作者合成了高活性分子探针12，并利用实验室最新研发的BTC-ABPP技术（Sun, H., Chem. Comm. 2016）成功地进行靶标鉴定工作，确认这一系列化合物是通过共价修饰了MLKL蛋白86位的半胱氨酸，并用生化手段进一步验证和阐述了TC13-172如何作用在MLKL蛋白，如何通过抑制其寡聚体的形成和向细胞膜的迁移，在最后一刻终止了细胞坏死的进程。

这一研究成果的另一重要性体现于，通过优化所获得的高活性抑制剂TC13-172首次揭示了MLKL作为药物靶标的可行性，不仅为开发以MLKL为靶向的抑制细胞坏死的药物奠定了基础，也为进一步研究MLKL介导的细胞坏死在不同疾病中所起的作用和探索MLKL其它的生物功能提供了有效的工具分子。

张志远实验室的学生闫博以及王晓东实验室的学生刘磊为本文共同第一作者。为本工作做出贡献的还有张志远实验室的黄少强，任艳博士，姚郑林，王晓东实验室的王华翌博士以及蛋白质谱中心的李琳和陈涉博士。张志远和王晓东为本文共同通讯作者。这项研究得到了科技部、基金委、北京市政府和HHMI的资助。