汤楠实验室发现肺泡一型细胞存在两种细胞亚型

    2018年2月20日，我所汤楠实验室在《PNAS》杂志在线发表了题为“The pulmonary alveolar type I cell population consists of two distinct subtypes that differ in cell fate”的研究论文，首次阐述了肺泡一型细胞在肺泡发育和肺泡再生过程中的异质性。

上图是在成年小鼠肺中由Igfbp2-CreER 谱系标记的表达膜GFP的单个肺泡一型细胞 （王艳杰提供）。这种细胞大而平，细胞膜有很多分支，这样的结构有利于与周围细胞建立紧密连接。细胞上有很多大小不一的孔（Khon孔）。Khon孔的形成机制和功能还有待研究。

    目前，我们已熟知肺泡一型细胞是肺泡上皮细胞的一种。但在60多年前，关于是否存在肺泡上皮细胞，科学界是存在巨大争论的。当时更为流行的观点是，气体交换表面仅由毛细血管组成。直到1952年，通过应用电子显微镜，科学家们才首次在大鼠肺组织中发现了肺泡 (lymphatic endotheia中存在中存在中两种上皮细胞：一型细胞（AT1）和二型细胞（AT2）。因此，才提出了气血屏障由内皮细胞和肺上皮细胞共同构成的理论，并开始了针对肺泡上皮细胞的研究。

此表总结了自发现至今的60多年里，关于AT1细胞的一些重要发现。

    自发现肺上皮细胞至今的60多年里，肺泡AT2细胞的代谢和功能已被科学家们较深入地进行了揭示。尽管大家都知道AT1细胞对于肺的气-血屏障功能尤为重要,在肺疾病中也更容易被损伤，但是对AT1细胞的研究却依然表浅，对AT1细胞的分子遗传学特征及异质性就更是知之甚少。这本身也阻碍了对AT1细胞的进一步研究。例如，传统认为AT1细胞被看作是终末分化的细胞。而最近一项研究发现，成年AT1细胞可能保留了细胞可塑性，能够在肺切除诱发的肺泡再生中增殖并产生AT2细胞。但这个令人兴奋的发现却也在领域里引起了争论。究其原因，还是因为领域里缺乏关于AT1细胞发育和异质性的认识，因此并不知道是全部或是仅有一部分AT1细胞能够转分化成AT2细胞。

那么，为什么人们对AT1细胞的认识依然表浅呢？这里面有两个主要原因：

    1. 分离AT1细胞有很大的技术挑战。首先，AT1细胞数量少， (lymphatic endotheia虽然AT1细胞覆盖了95％～98%以上的肺泡表面，但仅占肺里细胞总数目的10% (甚至更少)。其次，AT1细胞很大，难于从组织中消化分离。另外，AT1细胞又很薄很脆，容易破碎，进一步增加分离时的难度。

上图是成年小鼠肺泡AT1细胞的电镜图 （姜克武提供）。电镜发现人和小鼠的肺泡AT1细胞最薄的地方只有40-50nm, 这样的细胞结构有利于气体有效地扩散到血管。

    2. 无特异性标记物，分选难度很大。已往发现的AT1细胞标记物都不足够特异, 也就是在肺中其他细胞也有表达。例如：PDPN，作为AT1细胞的标记物，在肺脏的基底细胞 (basal cells)、淋巴管上皮细胞 (lymphatic endothelial cells)以及间皮细胞 (mesothelial cells)中都有表达。同样，AQP5在内皮细胞 (endothelial cells)和AT2细胞中也有表达。AGER在AT2细胞中也有表达。这样，想要分选纯度比较高的AT1细胞就十分困难。

    汤楠实验室的研究者将单细胞测序，小鼠遗传学和肺泡小体器官培养等技术相结合，第一次探究了在肺泡发育和再生过程中，AT1细胞在转录组水平上的变化，并因此发现了一个新的AT1细胞遗传分子标记物，即胰岛素样生长因子结合蛋白2（Igfbp2）。同时研究者也证实了Igfbp2在人的肺脏中也特异地在AT1细胞表达。

上图介绍研究者在出生后小鼠的不同发育阶段将AT1细胞分选出来进行单细胞测序。

    令人惊讶的是,在小鼠出生后Igfbp2才开始在AT1细胞里表达。利用该分子标记物，研究者发现出生后AT1细胞存在着两种细胞亚型：Igfbp2+Hopx+的AT1细胞和Igfbp2-Hopx+的AT1细胞。在新生小鼠的AT1细胞和再生新肺泡的AT1细胞中，Igfbp2表达不均一，随着肺泡发育和损伤后的恢复，Igfbp2阳性AT1细胞的比例逐渐增加。同时，研究者发现Igfbp2+Hopx+ AT1细胞是终末分化细胞，在正常发育或损伤后的肺再生中，Igfbp2+Hopx+ AT1细胞不能再转分化成AT2细胞。该研究结果支持在肺泡再生过程中，AT2细胞分化成AT1细胞过程中有个“非成熟”阶段，在这个阶段“非成熟”的AT1细胞有细胞可塑性，在损伤等特定地条件下可以转分化为AT2细胞。

上图显示刚出生（Postnatal day 0_P0)小鼠的肺泡AT1细胞不表达IGFBP2。 随着发育，肺泡里表达IGFBP2的AT1细胞比例逐渐增加。在60天的小鼠肺里，95%的AT1细胞表达IGFBP2。

上图显示在肺切除诱导的肺泡再生中，从AT2细胞新分化成的AT1细胞表达一些传统的AT1 细胞marker，比如Hopx,但在再生的初期 （day 14)并不表达IGFBP2 （F，被膜GFP标记的AT1细胞是新从AT2细胞分化来的AT1细胞）。随着分化的AT1细胞的“成熟 ”(day 45)，这些新的AT1细胞开始表达IGFBP2 （G and H）.

    这项研究为将来研究肺泡AT1细胞在肺泡再生和疾病进程中的作用提供了重要的研究基础,为AT1细胞命运的调控机制研究提供了工具和研究方向。另外，基于此研究，还有很多重要的问题值得去探索，比如，“成熟”的AT1细胞到底和“非成熟”的AT1细胞到底有什么不同？调控AT1细胞成熟的分子机制是什么？越来越多的证据表明AT1细胞不只具有被动的气体交换功能，AT1细胞会主动参与到肺再生和疾病的修复过程。未来汤楠实验室会继续推进对肺泡AT1细胞的细胞学和生理学研究。

    汤楠实验室PTN项目博士生王艳杰为本文第一作者。该论文的其他作者还包括汤楠实验室汤赞、李蛟、王诤、于元元和李娟，核酸测序中心的黄焕伟，转基因中心的王凤超博士，北京武警总医院的张成伟博士，中日友好医院的代华平博士。汤楠博士和蔡涛博士为本文共同通讯作者。该研究由北京市科委基金和中国国家重点研究与发展项目资助，在北京生命科学研究所完成。