CRISPR/dCas9/gRNA活细胞基因组标记系统的比较及优化

2018年3月22日，我所张昱实验室在《Genome Biology》杂志在线发表题为“Comparison and optimization of CRISPR/dCas9/gRNA genome-labeling systems for live cell imaging”的文章。

在后基因组时代，更多的研究开始关注基因组的三维空间结构对于基因的表达以及细胞命运的决定所起到的关键调节作用。为了研究细胞核内基因组的三维结构及动态变化，研究者们已经开发了各种各样的工具。例如，高通量染色质构象捕获技术（Hi-C）的出现，为理解基因在核内的空间分布以及相互作用关系提供了一个全新的视野。标记基因组特定序列然后用显微镜直接观察细胞核内基因组的结构和动态是一种更为经典的方法。

CRISPR/Cas9复合物包含行使剪切功能的Cas9蛋白以及特异靶向基因组的gRNA。通过gRNA序列与基因组序列的特异性匹配，Cas9蛋白能在基因组特定位置行使剪切功能。正是利用CRISPR/Cas9系统对基因组序列的高度特异性，陆续有研究组开发了基于此系统的基因组标记成像技术。在最初的报道中，研究人员将没有核酸酶活性的Cas9与荧光蛋白例如GFP直接融合表达，再配以靶向基因组特定位置的gRNA，在活细胞内实现基因组特定位点的标记。为了增加标记信号，研究人员将24次重复的GCN4多肽添加到dCas9的C端，同时将荧光蛋白与特异性识别GCN4的单链抗体scFv融合表达，通过这种方式可以将更多的荧光蛋白募集到单个Cas9/gRNA复合物上从而实现对所标记位点处荧光信号的增强。为了同时标记基因组多个不同位点，迄今为止主要开发了两种方法。首先，将不同细菌物种来源的不种CRISPR-Cas9同源蛋白与不同的荧光蛋白分别融合表达，再给以相对应特异Cas蛋白的靶向不同位点的gRNA，借此实现同时标记基因组不同位点。另一方面，已经发现一些RNA结合蛋白可结合特定的RNA序列，因此将gRNA用这些特定的RNA序列分别修饰，再同时表达不同荧光蛋白融合的相应RNA结合蛋白，实现在仅使用一种dCas9的情况下标记不同基因组位点。此外，通过增加RNA结合蛋白识别序列在gRNA上的拷贝数可实现信号的扩增。然而，CRISPR / dCas9 / gRNA在基因组标记领域仍然存在一些重要问题。特别是，对于目前方法的彻底和详细的比较和评估仍然缺失。

在本研究中，张昱实验室的研究人员首先系统地比较了目前主要的基于CRISPR/dCas9/gRNA的基因组标记成像方法。研究人员发现，在通过以修饰gRNA实现基因组特定位点标记的方法中，在dCas9缺失的条件下，也能在一定比例的细胞内观察到非特异性的信号点；通过实验，研究人员证明这些非特异性的信号点来自于细胞核内转录积累的修饰后的gRNA。

比较不同的dCas9/gRNA系统标记端粒

随后，为了解决这一问题，研究人员将GFP的C端、N端分别与dCas9和RNA结合蛋白融合表达，开发了基于dCas9/gRNA的双分子荧光互补方法的基因组成像系统。实验证明该方法相较于其他dCas9/gRNA标记系统，提高了信噪比，解决了在通过以修饰gRNA实现基因组特定位点标记的方法中存在的非特异性标记问题。

不同BIFC-dCas9/gRNA标记系统示意图

张昱实验室PTN项目博士生洪煜为本文第一作者。该论文的其他作者还包括张昱实验室芦广庆、段金志、柳文静。张昱博士为本文通讯作者。该研究由北京市政府“百千万人才计划”支持，在北京生命科学研究所完成。张昱博士的实验室同时由中组部“青年千人”及国家自然科学基金培养资助。