陈婷实验室发现干细胞微环境的异质性与可塑性如何影响干细胞再生能力的分子机制

2018年8月16日，陈婷实验室在《Cell Stem Cell》杂志在线发表了题为“Hoxc-dependent mesenchymal niche heterogeneity drives regional hair follicle regeneration”的研究论文。该论文发现在小鼠身体不同部位的皮肤中，Hoxc在干细胞微环境中的差异性表达引起下游Wnt信号通路的激活的差别，从而引起毛囊干细胞再生的位置性差异，揭示了干细胞微环境在身体水平的异质性与可塑性如何影响干细胞再生能力的分子机制。

表皮组织再生在机体水平通常具有区域特异性，比如毛发的生长和再生，汗腺的分布，黑色素细胞在表皮的密度等，都在身体不同部位展现出了非常大的位置差异。在早期的发育生物学实验中，科学家先将不同部位的表皮和真皮分离，然后进行异位组合的移植实验，最终证明表皮细胞的分化命运决定源自真皮组织的信号；然而，具体编码不同部位真皮细胞的分子机制并不清楚。为了研究区域特异性毛发再生能力的细胞和分子机制，研究人员以多毛突变体考拉鼠（Koa）作为切入点：Koa是由辐射造成的突变体，在其第15号染色体上有一段51Mb左右的染色体倒位，导致了Koa耳部和口鼻处的多毛表型，但是在倒位染色体的断点上并没有基因被打断，因此Koa突变表型的原因并不清楚。过去近20年对Koa突变基因的研究有过不同的结论，但都只是基因表达水平的检测，缺乏功能学实验的验证，而且报道最多的基因Trps1不能很好的解释看到的现象。

研究人员利用FACS分离了野生型小鼠的耳部和背部，以及Koa耳部的表皮细胞和真皮细胞，通过RNA高通量测序发现Koa断点附近的Hoxc基因在野生型小鼠的背部真皮和Koa耳部的真皮细胞内高表达，而在野生型小鼠的耳部不表达。研究人员通过RNA in situ的方法进一步证明了，Hoxc基因主要在真皮乳头（Dermal Papilla，DP）细胞中表达。接下来，研究人员利用Crisper／Cas9技术在Koa染色体上敲除了9个Hoxc基因（Hoxc4-Hoxc13），发现伴随着Hoxc在真皮中表达量的下降，Koa的多毛表型消失了——这证明Hoxc 基因家族是导致Koa多毛的原因。然而，在之后的实验中，如果只在Koa染色体上敲掉单个Hoxc基因（如Hoxc4或Hoxc8），Koa的多毛表型无法或无法全部消失；同时研究人员发现，虽然被敲掉的单个Hoxc基因的表达量有下调，但其他的Hoxc表达量却有增加，暗示着众多Hoxc基因以一种相互冗余的方式在发挥作用。于是，研究人员在野生型小鼠的耳部皮肤中，利用慢病毒在真皮细胞中过表达Hoxc基因，他们发现，无论是过表达Hoxc4，Hoxc6，还是Hoxc8，只有DP细胞被感染的毛囊生长能被促进。而在表皮中利用慢病毒过表达Hoxc4，6，8基因均没有任何表型。以上实验证明Hoxc基因在DP细胞中起作用，促进毛囊的生长和再生。

在此之后，为了探究Hoxc差异表达的上游调控，研究人员利用野生型小鼠的耳部真皮细胞和背部真皮细胞进行了ChIP-seq分析。他们发现，在野生型小鼠的耳朵上，Hoxc基因附近没有任何活跃增强子的修饰（H3K27ac），而有非常多的基因表达抑制性修饰（H3K27me3）；相反的，在野生型小鼠的背上，Hoxc4-10基因附近没有H3K27me3的修饰，却有很多H3K27ac的修饰。为了验证表观修饰对Hoxc表达的功能性影响，研究人员分析了Bmi1敲除小鼠的表型：Bmi1是Polycomb 复合体的重要组分之一，敲除后，H3K27me3的修饰无法正常添加。在此实验中，研究人员发现，Bmi1敲除小鼠耳部真皮细胞中，Hoxc基因的表达水平和野生型小鼠相比有明显增加；同时，耳部的毛发较野生型也有长度的增加。此外，研究人员还进一步探索了Koa鼠在染色体倒位后Hoxc的异常表达是如何实现的：他们发现，在染色倒位前，Hoxc基因处于一个十分沉默的拓扑相关染色体区域（Topological Associated Domain, TAD）内，其中并没有很多H3K27ac的修饰；然而，在染色体发生倒位后，Hoxc基因与断点外一段富含H3K27ac修饰的TAD区域相邻更近。于是研究人员利用4C-seq（Circularized Chromosome Conformation Capture）证实了Hoxc基因在Koa倒位后与断点外富含H3K27ac修饰区域的DNA互作。最终，研究人员发现Wnt信号通路位于Hoxc基因的下游，从而激活毛囊的再生。尤其有意思的是Hoxc下游刺激Wnt信号通路激活的基因Rspo2在人体突变会导致毛发缺失的疾病，所以接下来的研究将是进一步探索人类毛发发育和进化的细胞与分子机制。

陈婷实验室PTN项目博士生于宙为本文第一作者。该论文的其他作者还包括陈婷实验室的姜开菊，徐子健博士，钱南南，陆智伟博士，陈道明，狄若男，苑天艺，NIBS核酸测序中心的黄焕伟，清华大学的颉伟博士和杜振海，复旦大学的李华伟博士和鲁小玲博士，东南大学的柴人杰博士，北京大学第一医院的杨勇博士，中科院生物物理所的朱冰博士；陈婷博士和NIBS转基因中心的王凤超博士为本文的共同通讯作者。该研究由中国国家重点研究与发展项目、973项目资助，在北京生命科学研究所完成。