邵峰实验室揭示病原菌通过新颖的精氨酸糖基化修饰阻断宿主死亡受体信号通路的完整分子机理

2019年4月10日，我所邵峰实验室在《Molecular Cell》杂志在线发表题为“Structural and functional insights into host death domains inactivation by the bacterial arginine GlcNAcyltransferase effector”的研究论文，揭示了肠致病性大肠杆菌（EPEC）三型分泌系统效应蛋白NleB特异性识别并糖基化修饰宿主死亡结构域（dead domain, DD）的关键精氨酸，阻断死亡受体信号通路的完整分子机制。

早在2013年，邵峰团队在《Nature》杂志上报道，肠致病性大肠杆菌通过三型分泌系统效应蛋白NleB阻断宿主死亡受体信号通路，帮助病原菌在肠道内定植和感染，NleB具有糖基转移酶活性，特异性地糖基化修饰（N-乙酰葡萄糖氨，GlcNAcylation）宿主死亡受体通路中死亡结构域上的一个关键精氨酸，进而阻断死亡结构域的相互作用和信号复合体的组装；这种发生在精氨酸上的GlcNAcylation不同于常见的各种糖基化修饰，是一种全新的蛋白质翻译后修饰。但是NleB如何特异地识别宿主靶蛋白死亡结构域进而实现精氨酸GlcNAcylation的分子机制一直不清楚。

图1：NleB和被NleB糖基化修饰后的TRADD和RIPK1的死亡结构域的晶体结构

在这项研究中，研究人员首先解析了被NleB糖基化修饰后的TRADD和RIPK1蛋白的死亡结构域的高分率晶体结构，清晰地展示出修饰的GlcNAc以β构型的糖苷键与死亡结构域的关键精氨酸侧链胍基的N原子共价连接，研究人员又利用核磁共振的方法确证了溶液状态下精氨酸上的GlcNAc也是β构型的糖苷键。随后，他们进一步解析了NleB单独状态，以及与底物蛋白FADD-DD在配体UDP和Mn²⁺存在下的复合物的晶体结构，这些结构显示NleB具有GT-A型糖基转移酶的结构特征，其中的发夹样结构与Rossman折叠共同组成“C”样的凹槽构造，通过一系列的氢键和静电相互作用完美地识别和结合球形结构的死亡结构域。人的34种含有死亡结构域的蛋白有12种含有被NleB修饰的保守精氨酸，这其中有8种蛋白（包括接头蛋白TRADD、RIPK1、FADD，和跨膜受体蛋白TNFR1、FAS、DR3/4/5）被在死亡受体信号通路中发挥作用，通过与NleB共表达修饰检测、质谱鉴定和精氨酸定点突变等实验，研究人员发现NleB能够选择性的修饰除DR4和DR5以外的另外6种蛋白的死亡结构域，序列分析以及对TRADD、RIPK1和FADD的死亡结构域结构比较表明，NleB结合死亡结构域的氢键和静电相互作用是高度保守的，而DR4和DR5中关键的带电氨基酸发生了电性相反的取代，因而不能被NleB结合而修饰，进一步通过分别对NleB和DR5进行电荷互补性突变，可以让改造的NleB修饰野生型的DR5或者让野生型的NleB修饰改造的DR5。此外，复合物的晶体结构还清晰地展示了NleB的催化中心结合糖基供体UDP-GlcNAc和辅酶因子Mn²⁺的相互作用，以及特异地结合死亡结构域中被修饰的精氨酸的三维构造，在此基础上完整的揭示出NleB的催化机制：精氨酸侧链伸入NleB催化中心的狭长口袋，其胍基末端的N原子与NleB的E253以双氢键作用牢牢结合，E253作为催化碱活化精氨酸的胍基成为亲核试剂，而胍基末端的N原子刚好位于供体UDP-GlcNAc糖基1位C原子的β侧，通过直接的亲核取代反应，GlcNAc以β构型糖苷键共价连接到精氨酸侧链上，完成对底物死亡结构域的精氨酸GlcNAcylation。NleB利用的糖基供体是α构型糖苷键连接的UDP-GlcNAc，这也说明NleB是以inverting的催化机制完成精氨酸糖基化修饰的。通过定点突变、检测体外糖基化修饰、死亡受体通路介导的细胞凋亡、以及细菌在小鼠肠道感染定植的等实验，他们进一步证实了NleB特异地识别死亡结构域和催化精氨酸GlcNAcylation阻断死亡受体信号通路，发挥帮助病原菌感染和定植生理功能的结构基础。此外，体外的免疫共沉淀还实验发现，NleB可以高效地抑制死亡受体信号通路中多个死亡结构域间的相互作用，表明NleB是一种多效价的死亡受体信号通路抑制剂。

图2：NleB/FADD-DD复合物的晶体结构和对相互作用界面的功能分析

该研究不仅丰富了我们对病原菌通过新型翻译后修饰破坏宿主关键信号通路的认识，为针对NleB开发拮抗EPEC感染的药物奠定了理论依据。更为重要的是，NleB介导的精氨酸糖基化不同于已知的各种糖基化修饰，该研究成果提供了对这种全新蛋白质翻译后修饰的酶学反应机理提供了全面深入的理解，对病原菌效应蛋白NleB的改造和应用也将成为我们研究宿主死亡受体信号通路复杂多样的功能和调控机制的重要手段。

图3：NleB修饰和失活宿主死亡结构域及其通路的结构模型

来自中科院生物物理所的访问学者丁璟珒博士是本文的第一作者，该论文的其他作者还包括邵峰实验室的李姗博士（现为华中农业大学PI）课题组研究生、姚庆博士（现为Caltech博士后）、厦门大学化学化工学院高场核磁中心的姚宏伟博士和生物物理所的王大成教授，丁璟珒博士、李姗博士和邵峰博士是本文的共同通讯作者。该研究由科技部重点研发计划，中科院战略先导科技专项，中科院青促会项目以及国家自然科学基金委资助，在北京生命科学研究所完成。