邵峰实验室和北大刘志博实验室合作通过新型生物正交体系首次揭示细胞焦亡的抗肿瘤免疫功能

2020年3月11日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院邵峰实验室和北京大学化学与分子工程学院应用化学系刘志博实验室合作在《Nature》杂志在线发表题为“A bioorthogonal system reveals antitumour immune function of pyroptosis”的研究论文。该项研究通过在肿瘤原位可控激活细胞焦亡，首次揭示细胞焦亡可高效诱导机体产生抗肿瘤免疫活性。

细胞焦亡 (pyroptosis) 是一种炎症性细胞坏死，最初发现是机体拮抗病原微生物感染所启动的免疫防御机制，由活化的半胱氨酸蛋白酶caspase-1和caspase-4/5/11所介导。随着2015年邵峰实验室首次报道GSDMD蛋白作为caspase-1/4/5/11的共同底物来执行经典细胞焦亡，细胞焦亡研究自此全面展开。GSDMD属于Gasdermin蛋白家族，非激活时处于自抑制状态，在被活化的caspase切割之后，其具有细胞膜打孔活性的N端结构域被释放，在细胞膜上寡聚成孔，引发细胞焦亡 (Shi et al., Nature 2015; Ding et al., Nature 2016)。邵峰实验室也于2017年报道了该家族另外一成员GSDME做为caspase-3的底物来执行细胞焦亡，首次揭示GSDME是caspase-3活化后决定细胞死亡方式的关键分子 (Wang et al., Nature 2017)。由于Gasdermin家族成员都具有诱导细胞焦亡的活性，因此邵峰实验室在2017年将细胞焦亡重新定义为Gasdermin蛋白介导的程序性细胞坏死 (Shi et al., TiBS 2017)。非常有趣的是，多数Gasdermin家族蛋白的表达在肿瘤细胞中往往被沉默，暗示其在肿瘤发生或肿瘤清除可能发挥重要作用。此外，临床上多数肿瘤病人对肿瘤免疫治疗不响应的一个原因是肿瘤微环境里免疫反应受到抑制，细胞焦亡做为一种强烈的促炎性细胞死亡，是否能够改善肿瘤微环境的免疫反应也亟待研究。

为了实现在肿瘤原位特异激活细胞焦亡，该项研究首先基于硅烷脱硅化学反应开发了由苯丙硼氨酸 (Phe-BF₃) 介导的新型生物正交剪切反应体系，该体系可在体外以及细胞实验中实现生物活性分子的可控释放。随后，研究人员将生物正交技术在抗体偶联药物 (Antibody-drug conjugate, ADC) 中进行了初步应用，将抗体trastuzumab通过含有硅烷“启动子”的连接链 (SEC) 和化疗药物MMAE链接，构建了Trastuzumab-SEC-MMAE。通过PET-CT成像示踪，发现Phe-BF₃和Trastuzumab-SEC-MMAE只在小鼠肿瘤部位交叉富集。借由Phe-BF₃脱硅反应介导的碳酸酯基团断裂，将MMAE和trastuzumab的连接切断，实现了抗肿瘤药物MMAE在瘤内的高效释放。

在成功实现活性蛋白分子肿瘤原位可控释放的基础上，研究人员进一步开展了利用该生物正交方法在肿瘤内释放和激活Gasdermin蛋白的研究。基于上述金纳米颗粒及连接链，研究人员设计合成了连接Gasdermin的蛋白前药—NP-GSDMA3和NP-GSDMA3(mut) (E14K/L184D, 细胞膜打孔活性丧失突变体)。在细胞水平对该细胞焦亡诱导体系验证表明，当Phe-BF₃进入细胞后，可在胞内将GSDMA3蛋白从金纳米颗粒上释放出来从而引发明显的细胞焦亡；而没有打孔活性NP-GSDMA3(mut)在Phe-BF₃作用下则完全不能够引起细胞焦亡。

将NP-GSDMA3和Phe-BF₃的运用在活体时，通过PET-CT示踪，这两种药物同样能够在肿瘤部分交叉富集，实现双靶向肿瘤。给荷瘤小鼠进行NP-GSDMA3+Phe-BF₃焦亡激活治疗。三轮治疗结束后，4T1和EMT6肿瘤得到了很好的控制，和对照组有明显的差别。研究人员还设计了给小鼠尾静脉注射核酸染料Propidium Iodide的办法对肿瘤进行了分析，发现NP-GSDMA3+Phe-BF₃治疗组的肿瘤部位相对于对照组确实有更多的细胞焦亡发生，但对于整个肿瘤来说，细胞焦亡的比例低于15%。低比例的细胞焦亡能够引起肿瘤几乎完全消退，暗示了机体免疫反应可能参与了肿瘤清除。而当给T细胞功能缺陷的小鼠进行同样的治疗方案时，治疗组和对照组的肿瘤大小不再有显著差别。通过流式分析发现，相对于对照组，治疗组小鼠肿瘤内部的CD8⁺以及CD4⁺ T细胞显著增多，而调节性T细胞 (Treg) 比例下降。单细胞测序也显示了相似的结果，治疗组的肿瘤微环境中，CD8⁺以及CD4⁺ T细胞比例显著增加，而具有免疫抑制作用的M2型巨噬细胞以及MDSC细胞比例下降。进一步用CD8⁺以及CD4⁺ T细胞特异性抗体将对应T细胞从小鼠活体清除后，NP-GSDMA3+Phe-BF₃的治疗效果不再出现，证明T细胞介导的免疫反应确实参与到了细胞焦亡介导的肿瘤清除中。

免疫检查点抑制剂在临床治疗肿瘤中取得了巨大的成功，但是人群响应率低是其面临的最大难题。其中一个原因是这些肿瘤中浸润的免疫细胞少，肿瘤微环境中免疫反应弱。单独对4T1肿瘤进行Anti-PD1治疗或者进行一轮焦亡激活治疗时，肿瘤均不能得到控制；但是将两者进行联合时，4T1肿瘤得到了很好的控制。因此，在肿瘤原位激活细胞焦亡，能够促进免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果。

该研究工作一方面展现了基于三氟化硼脱硅反应的“双靶向激活”策略效率高、生物正交性好的优势，揭示了将探针改造为激活剂（Probing-to-Perturbing）这一设想在活体蛋白激活上的巨大潜力。利用这个新颖的生物正交技术，该研究揭示少部分的肿瘤细胞发生焦亡，就足以有效调节肿瘤免疫微环境，进而激活很强的T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，该发现为肿瘤免疫治疗药物研发提供了新的思路，Gasdermin家族蛋白也成为潜在的肿瘤免疫治疗的生物标志物，这类蛋白的激动剂则很有可能成为抗肿瘤药物研发的新方向。

刘志博实验室的博士生王钦阳和邵峰实验室的博士后王玉鹏是本文的共同第一作者，该论文的其他作者还包括中科院生物物理所的丁璟珒博士，刘志博实验室的研究生王春洪和交流生周雪涵，邵峰实验室的高文青博士和核酸测序中心黄焕伟硕士，邵峰博士和北京大学刘志博博士是本文的共同通讯作者。该研究由中核集团-国家自然科学基金联合基金，中组部青年千人计划，中科院战略先导科技专项，科技部重点研发计划，及中国医科院创新医学单元项目资助，在北京生命科学研究所和北京大学完成。