邵峰实验室和生物物理所丁璟珒实验室合作揭示细菌效应蛋白拮抗宿主抗细菌自噬的分子机理和细胞选择性自噬的通用机制

真核细胞通过自噬通路识别并抵御病原细菌感染的过程被称作抗细菌自噬或异源自噬。异源自噬通路的发生机制是自噬领域内研究的热点。2019年邵峰团队首次鉴定并报道了由V-ATPase-ATG16L1介导LC3激活的异源自噬通路，并且发现沙门氏菌III型分泌系统效应蛋白SopF可以通过ADP-核糖基化修饰V-ATPase亚基V_OC而特异破坏异源自噬的发生。但对于SopF在真核细胞中的调控、催化机制以及V-ATPase-ATG16L1通路触发机制的理解仍不全面。

2022年1月19日，北京生命科学研究所邵峰实验室和中科院生物物理所丁璟珒实验室合作在Nature Structural & Molecular Biology上发表了题为 ARF GTPases activate Salmonella effector SopF to ADP-ribosylate host V-ATPase and inhibit endomembrane damage-induced autophagy的研究成果。该研究揭示了SopF挟持真核细胞ARF GTPase发挥毒力作用的分子机理，并阐明了V-ATPase-ATG16L1通路响应内膜系统损伤而激活LC3的通用机制。

研究者首先利用免疫共沉淀-质谱技术鉴定沙门氏菌效应蛋白SopF与宿主细胞中一类小G蛋白ARF 特异结合。研究者随后纯化SopF-ARF1蛋白复合物，并解析其晶体结构 (图1左)。结构分析与位点突变等实验证明SopF属于白喉毒素样ADP-核糖基转移酶家族，以 “I-Y-E”为核心基序结合NAD⁺并催化底物V_OC第124位谷氨酰胺的ADP-核糖基化修饰。利用细菌感染、体外生化重组等实验，研究者还证明SopF对V_OC的修饰过程严格需要GTP结合形式ARF蛋白的帮助 (图1右)。细菌分泌的毒力因子依赖于宿主因子的激活机制反映了细菌在与宿主长期互作过程中进化出的一种精确调控的策略。

图 1 SopF-ARF1蛋白复合物结构（左）与体外重组V_OC的修饰实验（右）

2019年发表的工作发现细菌感染导致的包裹细菌的囊泡损伤是触发V-ATPase-ATG16L1激活的原因。研究者猜测内膜定位的质子泵V-ATPase可能是通过感知酸性细胞器腔内pH的异常变化而招募ATG16L1。为了验证这一猜想，研究者利用破坏溶酶体完整性或中和溶酶体酸性环境的化合物 (LLOMe、Nigericin或NH₄Cl) 处理细胞并强烈触发LC3的激活。溶酶体损伤导致的LC3激活可以被SopF过表达或V_OC第124位谷氨酰胺突变抑制 (图2左)。已有文献报道STING在结合cGAMP后会转位至高尔基体并发生寡聚，随即触发LC3的激活。

图 2 V_OC Gln124突变抑制溶酶体损伤引起的LC3激活（左）与体外V-ATPase质子泵活性实验（右）

在此基础上，研究者证明STING介导的LC3激活过程同样依赖于V-ATPase-ATG16L1通路。最后，研究者证明V_OC第124位谷氨酰胺的改变不会影响V-ATPase的质子泵活性 (图2右)。以上结果深入探讨了V-ATPase-ATG16L1通路的发生机制，证明内膜定位的V-ATPase通过感知内膜囊泡内酸性环境的异常改变而激活非经典自噬的全新功能。

作者通过对沙门氏菌异源自噬抑制蛋白SopF的调控与催化机制的深入研究，揭示了SopF利用真核细胞小G蛋白ARF激活自身酶学活性，进而催化V-ATPase复合物中V_OC亚基ADP-核糖基化修饰的机制。进一步研究发现V-ATPase并不是识别某个具体的来源于细菌的“非我”分子，而是识别细胞在各种病理生理条件下引发的内膜系统损伤。V-ATPase-ATG16L1通路广泛参与酸性细胞器膜损伤诱导的选择性自噬，为细胞内膜稳态维持与调控机制提供全新的研究方向。

北京生命科学研究所邵峰实验室博士后许悦博士 (现于上海交通大学医学院任课题组组长）为本文第一作者。该论文的作者还包括北京大学刘小云实验室程森博士，邵峰实验室的曾欢，周平博士，代谢中心马燕博士，蛋白质中心李琳。邵峰博士和丁璟珒博士为本文的共同通讯作者。该研究由国家自然科学基金委基础科学中心项目(81788104)、国家重点研究开发项目(2017YFA0505900，2016YFA0501500)和中国科学院战略重点研究项目(XDB08020202)资助，主要在北京生命科学研究所完成。