Nature Communications | DOPA交联剂为交联质谱技术开辟新的应用场景

2022年3月18日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院董梦秋实验室联合北京大学雷晓光实验室和唐淳实验室，在《Nature Communications》在线发表了题为“Characterization of protein unfolding by fast cross-linking mass spectrometry using di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers”的研究论文(DOI:10.1038/s41467-022-28879-4)。该文章报道了一类既可以在近生理条件下，也可以在使蛋白质变性的条件下，十秒钟快速反应的交联剂DOPA。DOPA为交联质谱技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry,简称CXMS或XLMS）开辟了全新的应用领域，包括捕获蛋白质变性去折叠的中间态和终态构象，以及追踪蛋白质构象变化过程。

交联质谱技术利用化学交联剂将蛋白质或蛋白质复合体中空间距离足够接近的两个氨基酸通过共价键连接起来，酶切后用质谱鉴定出交联肽段和交联位点，从而获得蛋白结构信息。由于这一技术简便高效而且提供的结构信息精确到氨基酸位点，它已经成为辅助解析蛋白复合体三维结构和检测蛋白-蛋白相互作用的有力工具。

董梦秋实验室一直致力于交联质谱技术的开发，与计算科学、有机合成、生物物理等领域的研究者合作开发了pLink系列软件（pLink, pLink-SS, pLink2），多种交联剂（Leiker, Diazoker, ArGO and KArGO），以及通过交联质谱解读蛋白质动态的方法（open vs closed conformation, specific vs encounter complexes）。此次开发的以DOPA2为代表的邻苯二甲醛类交联剂与蛋白质表面的氨基反应，其形成交联的速度比常用的NHS酯类交联剂DSS快60-120倍，可实现10秒反应、5秒终止，并且耐受低温、低pH值、高浓度变性剂如8M尿素和6M盐酸胍等条件。

DOPA为交联质谱技术开辟的新应用场景是本文的亮点。作者首先用它分析了单结构域蛋白—金黃色葡萄球菌核酸酶(SNase)—在不同浓度变性剂（0-8M 尿素）中的构象状态，捕获到了SNase在2-4M尿素浓度区段从折叠态到去折叠态的转换，以及圆二色谱和荧光光谱等传统方法没有检测到的、一触及1M尿素即发生的局部去折叠状态。

接着，作者以具有多个结构域的牛血清白蛋白（BSA）为研究对象，逐渐增加尿素浓度，用DOPA2交联质谱技术解析了BSA的变性过程：低浓度（1-2M）尿素破坏BSA单体之间的相互作用，体现在单体-单体之间的交联迅速降低；单体内不同结构域之间的相互作用也开始受到影响，其程度随尿素浓度升高而加剧，直至在6M 尿素条件下完全消失；结构域内部的相互作用最为稳定且表现出协同性，相应的交联在0-4M和6-8M尿素浓度区段都没有明显改变，只在4-6M区段大幅度降低。

最后，作者利用DOPA2交联反应快速发生并可以快速终止的特点对牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）在8M尿素中的连续变性过程进行追踪，再结合分子动力学模拟，获得了RNaseA去折叠中间体的构象集合。

图1.通过DOPA2交联质谱技术分析BSA在不同浓度尿素中的变性状态。

图2.通过DOPA2交联质谱技术分析RNaseA在8M尿素中的变性过程。

这些应用实例说明基于快速交联剂的交联质谱技术是检测蛋白质构象变化的灵敏工具。这一工作拓展了交联质谱技术的应用范围，代表了该技术从关注状态到关注过程、从分析静态到分析动态的升级转化，为今后的技术发展开辟了新的方向。

董梦秋研究员，雷晓光教授和唐淳教授为本文共同通讯作者。董梦秋实验室的王建华博士以及雷晓光实验室的唐毓良博士为本文的共同第一作者。为本工作做出贡献的还有武汉物理与数学研究所的龚洲博士，马萨诸塞大学医学院的RohitJain博士，原董梦秋实验室的谭丹博士，北京生命科学研究所黄牛实验室的黄牛研究员、周宇博士，雷晓光实验室的肖凡、李强博士，中科院生物物理所的叶克穷研究员，以及云南大学的柳树群教授。经费支持主要来自科技部、基金委和北京市政府。